Technologie 3730xl DNA Analyzer Applied Biosystems
Guide d’utilisation
Les instructions de ce guide doivent être suivies attentivement afin d’obtenir les meilleurs résultats possibles et d’éviter tout délai dans le traitement de la requête.
Tous les échantillons ne se conformant pas aux recommandations pourraient être refusés sans compensation.
Noter que les délais d’exécution peuvent varier selon l’ampleur du projet. Il est recommandé de s’informer des délais de traitement auprès du Bureau de gestion clients.
- Matériel de départ
- Requis
- Amorces
- Contenants exigés et identification des échantillons
- Requête de service et soumission des échantillons
- Envoi des échantillons
- Transmission des résultats
Matériel de départ
| Type d’échantillon | Préparation |
|---|---|
| Échantillon biologique requérant de l’extraction | Contacter le Bureau de gestion clients pour de l’information sur le service d’extraction. |
| ADN génomique (ADNg) | Kits commerciaux recommandés. Protocole maison : une étape de purificationsupplémentaire avec un kit commercial est requise pour éliminer toute trace de phénol/chloroforme. Élution : tampon Tris 10 mM, pH 8,5 ou eau ultrapure sans nucléase. |
| Culture de bactéries | Culture en milieu liquide (~8 heures) |
Requis
| Type d’échantillon | Volume | Concentration | Méthode recommandée de vérification de la concentration | Méthode recommandée de vérification de la pureté | Critère de qualité à rencontrer |
|---|---|---|---|---|---|
| ADNg | 10 µL d’ADNg par fragment à analyser | 20 ng/µL | Qubit ou méthode fluorimétrique équivalente. Note : Les méthodes spectrophotométriques comme Nanodrop sont beaucoup moins précises pour mesurer la concentration d’ADN. | Nanodrop ou autre méthode spectrophotométrique. Ratios de densité optique visés : – 260/280 entre 1,8 et 2,0 – 260/230 entre 2,0 et 2,2 | Non dégradé ou fragmenté. |
| Culture de bactéries | 1 mL | Ratios de densité optique visés : – OD600 minimale : ~0,4 à 0,6 (bactéries en pleine croissance) – OD600 maximale : ~1,0 à 1,2 (pour éviter la surpopulation, qui peut induire des stress cellulaires et diminuer la qualité des biomolécules) | Spectrophotométrique. |
Amorces
Amorces de PCR à designer
Si les amorces de PCR sont à designer, fournir les informations requises comme le numéro de rs (Reference SNP), la séquence de référence, la position dans le génome selon UCSC Genome Browser, l’espèce, etc.
Amorces de PCR dont la séquence est fournie
Lorsque la séquence des amorces de PCR est fournie par le client, indiquer :
- Si ces amorces sont à commander et si oui, donner le nom et la séquence de chaque amorce sens et antisens dans le Formulaire de soumission d’échantillons dans l’onglet correspondant.
- Si elles font partie des amorces standards offertes gratuitement par le service d’Amplification PCR – Séquençage Sanger, voir la liste suivante :
| 27F | 5’ – AGAGTTTGATCMTGGCTCAG – 3’ |
| 1492R | 5’ – TACGGYTACCTTGTTACGACTT – 3’ |
| ITS1F | 5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′ |
| ITS4 | 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′ |
Amorces de PCR et/ou de séquençage fournies
Lorsque les amorces de PCR et/ou de séquençage sont fournies par le client, les règles suivantes sont à respecter:
- Les amorces ne doivent pas contenir de SNP connu, pour toute demande de précision contacter le Bureau de gestion clients.
- La taille des amorces doit se situer entre 18 et 24 bases.
- Le ratio G/C devrait être de 40 à 60%.
- La taille des produits de PCR doit se situer entre 250 et 750 bases.
- La température d’hybridation (Tm) des amorces doit être supérieure à 50°C.
- Les amorces doivent se situer à au moins 100 bases de la région cible à séquencer.
- Le design d’amorces en amont de régions homo ou hétéropolymériques (répétition de A, C, G ou T) doit être évité car ces régions sont extrêmement difficiles à séquencer.
- La Tm ainsi que le % GC des amorces doivent être fournies.
| Type d’échantillon | Volume | Concentration |
|---|---|---|
| Amorce | 5 µL par échantillon à analyser | 20 µM |
Contenants exigés et identification des échantillons
- 48 échantillons et moins : tubes en « strip » ou plaque PCR 96 puits.
- 48 échantillons et plus : plaque PCR 96 puits.
Le nom inscrit sur le tube ou la plaque doit être unique, lisible, court et identique à celui indiqué dans le formulaire de soumission.
Les échantillons doivent être placés dans la plaque comme indiqué dans le formulaire de soumission – Disposition en rangée obligatoire.
Ceci pour éviter tout retard dans le traitement de la demande.
| Type d’échantillon | Contenant exigé | Contenants recommandés | Contenants refusés |
| Culture de bactérie | – Tube de 1,5 mL Tout type de tube de 1,5 mL avec un couvercle attaché (snap cap) est accepté. Exemple : DNA LoBind Tubes, 1.5 mL, PCR clean, colorless; Eppendorf, Cat # 022431021 | ||
| ADNg | – Tubes PCR en « strip » de 8 ou 12 Tout type de tube PCR en « strip » de 8 ou 12 d’un volume de 200 µL avec bouchon est accepté. Exemple: 0,2 mL PCR strip tubes with 12 well, VWR, Cat # 53509-300 Et strip domed caps for 12 well strips, VWR, Cat # 53509-302 – Plaque PCR à demi-jupe Tout type de plaque PCR claire à 96 puits à demi-jupe (half-skirt 96-well PCR plate) est accepté. Exemple: Thermo-Fast 96 PCR detection plate with flat deck; Life Technologie, Cat# AB1400L – Plaque PCR à jupe pleine Tout type de plaque PCR claire à 96 puits à jupe pleine (full-skirt 96-well PCR plate) est accepté. Exemple: Microseal PCR plates 96-well clear; Bio-Rad, Cat# MSP9601 Scellants pour plaque recommandés: – Film adhésif clair (Thermo Fisher Scientific, Cat# AB-0558) – Bouchons en « strip » de 8 ou 12 assurant l’étanchéité – Thermoscellage pour éviter toute fuite ou contamination croisée | – Plaque pour culture cellulaire – Plaque PCR opaque – Plaque PCR sans jupe (no-skirt) |
Requête de service et soumission des échantillons
Cliquer sur requête de service et soumission des échantillons pour consulter les instructions.
Envoi des échantillons
Cliquer sur préparation des échantillons pour envoi pour consulter les instructions.
Transmission des résultats
Les résultats de séquençage et d’analyse, si applicable, sont directement accessibles par l’application web Nanuq.
Un courriel est envoyé à la fin du projet informant de la disponibilité des résultats.
✔️ Les chromatogrammes et les séquences textes (format FASTA ou GenBank) peuvent y être visualisés et être téléchargés localement.
✔️ Le rapport d’analyse de détection de SNP contient les informations suivantes :
- La position des SNPs trouvés dans le génome
- Le numéro d’identification (rs) si le SNP est déjà répertorié
- Le génotype de chaque échantillon analysé
- Si le SNP est intronique ou exonique et dans ce dernier cas, s’il s’agit d’un SNP synonyme ou non-synonyme
- Le changement d’acide aminé le cas échéant.
Le rapport Excel contient un onglet avec un tutoriel pour aider à l’interprétation des données.
✔️ Le rapport Excel d’analyse de génotypage contient le génotype de chaque échantillon analysé.
✔️ Le rapport Word d’analyse de BLAST contient l’espèce et le genre, la valeur E, le pourcentage d’identité et le numéro d’accession.
En tout temps, pour toute question, contacter le Bureau de gestion clients.
Version 1.0_2025-11-06