Technologie Oxford Nanopore
Guide d’utilisation
Les instructions de ce guide doivent être suivies attentivement afin d’obtenir les meilleurs résultats possibles et d’éviter tout délai dans le traitement de la requête.
Tous les échantillons ne se conformant pas aux recommandations pourraient être refusés sans compensation.
- Matériel de départ
- Requis – Qualité et quantité
- Contenants exigés et identification des échantillons
- Requête de service et soumission des échantillons
- Envoi des échantillons
- Transmission des résultats
Matériel de départ
| Matériel de départ |
|---|
| ADN génomique bactérien. |
| – Kit d’extraction recommandé : kits commerciaux provenant des compagnies NEB, QIAGEN ou Zymo. – Protocole maison : une étape de purification supplémentaire avec un kit commercial est requise. Si ces recommandations ne sont pas suivies, la qualité du séquençage peut être compromise, voire entraîner un échec. |
Requis – Qualité et quantité
La quantité et la qualité des échantillons sont cruciales pour l’obtention de séquences de qualité.
| Type d’échantillon | Quantité | Concentration | Volume | Critère de qualité à rencontrer | Méthode de vérification conseillée | Impact sur le séquençage |
|---|---|---|---|---|---|---|
| ADN génomique bactérien | 3 µg | ~ 100 ng/µL idéalement Les échantillons faiblement concentrés produisent des lectures plus courtes et génèrent un rendement plus faible lors du séquençage. | 20 µL minimum 200 µL maximum | Double brin, non dégradé | Taille et intégrité vérifiées par gel d’électrophorèse | Échantillon dégradé/fragmenté : peut entraîner un échec de séquençage, faute de consensus, en raison de l’absence de lectures complètes |
Les échantillons doivent être élués dans du tampon Tris 10 mM, pH 8,5 ou de l’eau ultrapure sans nucléase.
Le client est responsable de fournir des échantillons de bonne qualité et en quantité suffisante. Les échecs de séquençage dues au non-respect des requis seront facturés.
Vérification de la concentration
- Méthode recommandée : Qubit ou méthode fluorimétrique équivalente.
Note : Les méthodes spectrophotométriques comme le Nanodrop sont non recommandées pour mesurer la concentration d’ADN puisqu’elles ont tendance à surestimer la concentration en ADN. Particulièrement pour les échantillons à faible concentration ou issus d’extractions complexes.
Vérification de la pureté
- Méthode recommandée : Nanodrop ou autre méthode spectrophotométrique.
| Ratio | Valeur attendue | Problème si hors limite | Impact sur le séquençage |
|---|---|---|---|
| 260/280 | Entre 1,8 et 2,0 | Contamination par protéines, phénol. Ou mesure instable due à une concentration trop faible. | Mauvais rendement ou échec du séquençage |
| 260/230 | Entre 2,0 et 2,2 | Contamination par sels, solvants, résidus chimiques. Ou mesure instable due à une concentration trop faible. | Mauvais rendement ou échec du séquençage |
- Si un kit Qiagen est utilisé : effectuer l’étape facultative de lavage au tampon PB pour augmenter la pureté.
Contenants exigés et identification des échantillons
- 16 échantillons et moins : tube de 1,5 mL
- 17 échantillons et plus : plaque PCR 96 puits
Identification des tubes et plaques :
- Nom unique, court et lisible.
- Identique à celui indiqué dans le formulaire de soumission.
- Échantillons en plaque – Disposition en colonne uniquement et tel qu’indiqué dans le formulaire.
Ceci pour éviter tout retard dans le traitement de la demande.
| Tubes exigés | Plaques PCR de 96 puits recommandées | Plaques de 96 puits non acceptées |
|---|---|---|
| –Tube de 1,5 mL Tout type de tube d’un volume de 1,5 mL est accepté. | – Plaque PCR à demi-jupe Tout type de plaque PCR claire à demi-jupe (half-skirt 96-well PCR plate) est accepté. Exemple: Thermo-Fast 96 PCR detection plate with flat deck; Life Technologie, Cat# AB1400L – Plaque PCR à jupe pleine Tout type de plaque PCR claire à jupe pleine (full-skirt 96-well PCR plate) est accepté. Exemple: Microseal PCR plates 96-well clear; Bio-Rad, Cat# MSP9601 | – Plaque pour culture cellulaire – Plaque PCR opaque |
| Scellage Exigé : bouchons en strip 8 ou 12 ou thermoscellage À éviter : scellants adhésifs (risque de fuite ou contamination) |
Requête de service et soumission des échantillons
Cliquer sur requête de service et soumission des échantillons pour consulter les instructions.
Envoi des échantillons
Cliquer sur préparation des échantillons pour envoi pour consulter les instructions.
Transmission des résultats
Un message automatisé provenant de Nanuq est envoyé à la personne ayant effectué la soumission dès que les séquences sont disponibles.
Les résultats de séquençage sont directement accessibles par l’application web Nanuq.
Chaque dossier de résultat de séquençage contient :
| Génome bactérien |
|---|
| – Un rapport complet avec les statistiques et les informations de chaque échantillon – Les fichiers FASTQ bruts – Un assemblage (.fasta) – Un fichier d’annotation (.gff) – Un assemblage annoté en format GenBank (.gbk) |
Ces fichiers peuvent être téléchargés localement.
Tous les échantillons seront conservés pour un maximum de 2 semaines après le séquençage avant d’être détruits.