Séquençage de plasmide entier et de long PCR

Technologie Oxford Nanopore

Guide d’utilisation

Les instructions du présent guide doivent être suivies attentivement afin d’obtenir les meilleurs résultats possibles et d’éviter tout délai dans le traitement de la requête.

Tous échantillons ne se conformant pas aux recommandations pourraient être refusés sans compensation.

Matériel de départ

PlasmideProduit de PCR
ADN plasmidique circulaire double brin de moins de 25 kb.  Produit de PCR de plus de 1500 pb et de moins de 25 kb.  
– Kit d’extraction recommandé : kits QIAGEN

– Protocole maison : une étape de purification supplémentaire avec un kit commercial est requise.

Si ces recommandations ne sont pas suivies, la qualité du séquençage peut être compromise, voire entraîner un échec.  		– Les produits de PCR doivent avoir été purifiés par une méthode à base de billes magnétiques de type AMPure*.

*Le service de purification par billes est offert moyennant des frais et un délai de traitement supplémentaires. Contacter le Bureau de gestion clients pour plus d’information.
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Requis – Qualité et quantité

Les échantillons doivent être élués dans du tampon Tris 10 mM, pH 8,5 ou de l’eau ultrapure sans nucléase.

Type d’échantillonVolumeConcentrationCritère de qualité à rencontrerMéthode de vérification conseilléeImpact sur le séquençage
Plasmide      20 µL        40 ng/µL*  Circulaire, double brin, intact  Taille et intégrité vérifiées par gel d’électrophorèse  Échantillon dégradé/fragmenté : peut entraîner un échec de séquençage, faute de consensus, en raison de l’absence de lectures complètes
Produit de PCRLinéaire, double brin, intact

*Les échantillons peu concentrés sont souvent fortement dégradés, ce qui nuit beaucoup à la qualité des résultats.

Les échantillons trop concentrés conduisent à un échec du séquençage.

Il est impératif de diluer les échantillons à la concentration requise de 40 ng/µL.

Il est important que la concentration des échantillons ne dépasse pas 50 ng/µL.

Vérification de la concentration
  • Méthode recommandée : Qubit ou méthode fluorimétrique équivalente.

Note : Les méthodes spectrophotométriques comme Nanodrop sont beaucoup moins précises pour mesurer la concentration d’ADN.

Vérification de la pureté
  • Méthode recommandée : Nanodrop ou autre méthode spectrophotométrique.
  • Ratios de densité optique visés :     
    • 260/280 entre 1,8 et 2,0
    • 260/230 entre 2,0 et 2,2.
  • Si un kit Qiagen est utilisé : effectuer l’étape facultative de lavage au tampon PB pour augmenter la pureté.
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Contenants exigés et identification des échantillons

  • 16 échantillons et moins : tube de 1,5 mL
  • 17 échantillons et plus : plaque PCR 96 puits

Le nom inscrit sur le tube ou la plaque doit être unique, lisible, court et identique à celui indiqué dans le formulaire de soumission.

Les échantillons doivent être placés dans la plaque comme indiqué dans le formulaire de soumission – Disposition en colonne obligatoire.

Ceci pour éviter tout retard dans le traitement de la demande.

Tubes exigés  Plaques PCR  de 96 puits recommandées  Plaques de 96 puits non acceptées  
– Tube de 1,5 mL

Tout type de tube d’un volume de 1,5 mL est accepté.		– Plaque PCR à demi-jupe  

Tout type de plaque PCR claire à 96 puits à demi-jupe (half-skirt 96-well PCR plate) est accepté.
Exemple: Thermo-Fast 96 PCR detection plate with flat deck; Life Technologie, Cat# AB1400L

– Plaque PCR à jupe pleine  

Tout type de plaque PCR claire à 96 puits à jupe pleine (full-skirt 96-well PCR plate) est accepté.
Exemple: Microseal PCR plates 96-well clear; Bio-Rad, Cat# MSP9601    		– Plaque à 96 puits pour culture cellulaire

– Plaque PCR à 96 puits opaques  
 Les plaques doivent être scellées à l’aide de bouchons en strip de 8 ou 12 ou un thermoscellage qui assurent l’étanchéité de chaque puits. Les scellants adhésifs sont à éviter en raison du risque élevé de fuite et de contamination croisée.   
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Requête de service et soumission des échantillons

Cliquer sur requête de service et soumission des échantillons pour consulter les instructions.

Il est fortement recommandé de fournir une séquence de référence pour le séquençage de produit de PCR. Le but est de faciliter la reconstruction de la séquence consensus si la qualité de l’amplicon est mauvaise et surtout si l’échantillon contient plus d’une séquence amplifiée. 

Les seuls formats acceptés sont Fasta (.fa, .fasta), SnapGene (.dna), Genbank(.gb, .gbk), Ape (.ape), texte (.txt, séquence seule, sans en-tête ou autre information).

Envoi des échantillons

Cliquer sur préparation des échantillons pour envoi pour consulter les instructions.

Transmission des résultats

Un message automatisé provenant de Nanuq est envoyé à la personne ayant effectué la soumission dès que les séquences sont disponibles.

Les résultats de séquençage sont directement accessibles par l’application web Nanuq.

Chaque dossier de résultat de séquençage contient :

PlasmideProduit de PCR
– Une séquence consensus (.fasta).

– Un fichier avec les statistiques de chaque base de la séquence consensus (.xlsx).

– Deux graphiques rapportant la qualité ainsi que la taille des lectures observées lors du séquençage (.png).

– Une carte annotée de la séquence consensus pouvant être visualisée dans un navigateur web (.html) ou avec l’aide d’un logiciel tel que snapgene ou snapgene-viewer (.gbk).

– Un alignement de la séquence consensus avec la séquence de référence, si fourni (.aln). Cet alignement peut être visualisé de façon pratique à l’aide du logiciel snapgene ou snapgene-viewer.  		– Une séquence consensus (.fastaq).

– Un fichier avec les statistiques de chaque base de la séquence consensus (.xlsx).

– Un rapport de séquençage pouvant être visualisé dans un navigateur web.  

Ces fichiers peuvent être téléchargés localement.

Tous les échantillons seront conservés pour un maximum de 2 semaines après le séquençage avant d’être détruits.

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Version 1.0_2025-10-01