Guide d’utilisation
Les instructions de ce guide doivent être suivies attentivement afin d’obtenir les meilleurs résultats possibles et d’éviter tout délai dans le traitement de la requête.
Toutes les librairies ne se conformant pas aux recommandations pourraient être refusées sans compensation.
Noter que les délais d’exécution peuvent varier selon l’ampleur du projet. Il est recommandé de s’informer des délais de traitement auprès du Bureau de gestion clients.
- Informations générales
- Matériel de départ
- Requis – Volume et concentration
- Contenants exigés et identification des échantillons
- Requête de service et soumission des échantillons
- Envoi des échantillons
- Transmission des résultats
Informations générales
Structure d’une librairie pour séquençage Illumina
La préparation des librairies pour le séquençage Illumina peut être réalisée à l’aide de trousses commerciales ou de protocoles adaptés avec des amorces personnalisées.
Une librairie prête à séquencer comprend des adaptateurs ajoutés de part et d’autre de l’insert. Ces adaptateurs contiennent :
- Les séquences P5 et P7 : permettent la liaison à la flowcell.
- Les amorces de séquençage : utilisées pour les lectures Read 1 et Read 2, ainsi que pour les index.
- Les index (i5 et i7) : courtes séquences (6–10 bases) qui servent à distinguer les échantillons lors du multiplexage. L’index 1 (i7) est lu en premier, l’index 2 (i5) en second.
- Les index moléculaires (UMI, Unique Molecular Identifiers) : séquences de 10–18 bases permettant d’identifier chaque fragment d’ADN et de distinguer les duplicats PCR. Leur position varie selon la trousse utilisée (après i7, à la place d’i5 ou au début du Read 1).
Les barcodes in-line (intégrés directement dans le Read 1 ou 2) ne doivent pas être confondus avec les index Illumina. Ils ne sont pas pris en charge par les pipelines standards (incluant Nanuq, l’application web du CES).
Figure 1 – Structure d’une librairie pour séquençage Illumina
Schéma illustrant la construction d’une librairie prête au séquençage. Les adaptateurs fixés de part et d’autre de l’insert contiennent les séquences nécessaires à la liaison sur la flowcell (P5 et P7), aux amorces de séquençage (Read 1, Read 2, Index 1, Index 2) ainsi qu’aux index (i5 et i7) permettant le multiplexage. Selon la trousse utilisée, un index moléculaire (UMI) peut également être présent.
Référence des séquences d’adaptateurs
Les séquences exactes des adaptateurs et amorces Illumina ne sont pas reproduites dans ce guide. Elles sont disponibles sur le site officiel d’Illumina : Illumina Adapter Sequences
Complexité des librairies
La technologie Illumina requiert une diversité suffisante de bases, particulièrement au début de la lecture, pour garantir des données de qualité optimale.
Les librairies qui ne présentent pas une distribution aléatoire de bases (faible complexité) doivent donc être clairement identifiées, car elles peuvent réduire la performance du séquençage.
Ces librairies incluent notamment :
- Amplicons (PCR)
- Librairies RAD (restriction site–associated DNA)
- Librairies à complexité réduite utilisées pour les analyses de méthylation, telles que celles obtenues par conversion au bisulfite ou par méthylation enzymatique (ex. methylseq / EM-seq)
Pour compenser une faible complexité, le service de séquençage peut ajouter une librairie de contrôle (PhiX174, Illumina) à un niveau de 10 à 50 %, selon la librairie initiale. Cet ajout réduit toutefois la proportion de lectures attribuées aux échantillons d’intérêt.
Les résultats de séquençage seront fournis tels quels. Le Centre d’expertise et de services ne peut être tenu responsable de problèmes liés au design, à la qualité ou à la complexité de séquence des librairies.
Diversité des librairies indexées et recommandations de multiplexage
Pour assurer une diversité adéquate lors de la lecture des index, il est recommandé de combiner au moins trois librairies indexées par ligne de séquençage. Cette pratique contribue à maintenir la qualité des données, même pour des librairies présentant une complexité normale.
Les demandes particulières concernant le regroupement des librairies ne peuvent pas toujours être satisfaites.
Le CES se réserve le droit de modifier les schémas de multiplexage sans préavis. Toute demande spécifique doit être mentionnée dans la colonne des commentaires lors de la soumission des librairies.
Matériel de départ
Le matériel de départ est une librairie ou un pool de librairies comportant les adaptateurs requis pour le séquençage Illumina.
Requis – Volume et concentration
- Les librairies doivent être diluées dans du tampon Tris-HCl (10 mM) ou de l’eau ultrapure sans nucléase.
- Les librairies ne doivent pas contenir d’agents chélatants (ex. EDTA) ou la concentration doit être réduite à 0,1 mM.
| Requis | Minimum | Maximum |
|---|---|---|
| Volume | ≥ 25 µL par librairie* | 110 µL |
| Concentration | ≥ 2 nM pour chaque librairie* | 60 ng/µL |
- Le volume inscrit dans le formulaire de soumission d’échantillons doit correspondre exactement au volume physique dans la plaque.
- Le volume maximal accepté est de 110 µL ; tout excédent sera jeté sans préavis.
- Si le volume minimal de librairie n’est pas respecté, un diluant sera ajouté pour atteindre le volume requis sans préavis.
- La concentration des librairies ne doit pas être supérieure à 60 ng/µL. Les librairies trop concentrées devront être diluées et le contrôle de qualité (CQ) sera repris. Des délais et frais supplémentaires peuvent s’appliquer.
- Les librairies de remplacement doivent avoir la quantité totale requise. Les remplacements partiels (« top-ups») seront refusés.
- Il est préférable de n’envoyer que des aliquotes des librairies. Les librairies ne seront pas retournées et elles seront détruites 3 mois après la complétion du projet, sans préavis.
Vérification de la concentration
Méthode recommandée : quantification par qPCR, qui cible spécifiquement les adaptateurs nécessaires au séquençage Illumina.
Note : Les méthodes basées sur l’absorbance aux UV (ex. Nanodrop) ou la fluorescence (ex. PicoGreen) mesurent l’ADN total, mais ne permettent pas de distinguer les molécules portant les adaptateurs P5 et P7.
Amorces de séquençage
Les amorces de séquençage personnalisées (si requises) doivent être envoyées dans des tubes 1,5 mL.
Les tubes doivent être clairement identifiés:
- Nom de l’investigateur principal et nom de l’amorce
- Concentration de l’amorce
- Utilisation au séquençage (Read 1, Read 2, Index 1 ou Index 2)
| Requis | Volume | Concentration |
|---|---|---|
| NovaSeq | ≥ 30 µL * *volume minimum par amorce et par ligne de séquençage | 100 µM |
| NextSeq | N/A | N/A |
Contenants exigés et identification des échantillons
- Tout envoi de librairie doit être fait en plaque PCR de 96 puits.
- Chaque plaque doit contenir uniquement les librairies appartenant à une seule soumission d’échantillons.
- Chaque plaque doit être identifiée exactement comme dans la soumission d’échantillons.
- Les librairies doivent être placées dans la plaque comme indiqué dans la soumission d’échantillons.
| Plaques exigées | Plaques non acceptées |
|---|---|
| Plaque PCR à jupe pleine (full skirt) – BioRad Hard-Shell 96-Well PCR Plates, skirted, Cat# HSP9601 – Eppendorf twin.tec, Cat# 951020401 – Corning Thermowell GOLD, Cat# 3752 – Axygen 96-well PCR Microplate, Cat# PCR96FSC – 96 well 0.2mL Skirted PCR plate – Grey ultra rigid frame, Cat# IST-601-096GCT | – Plaque à 96 puits pour culture cellulaire – Plaque PCR à 96 puits demi-jupe (half-skirt) – Plaque PCR à 96 puits sans jupe (no-skirt) |
| Scellants adhésifs recommandés – Film adhésif clair Life Technologies MicroAmp® Clear Adhesive Film, Cat# 4306311 – Film adhésif en aluminium VWR Aluminum Foils for PCR and Cold Storage, Cat# 60941-074 |
Requête de service et soumission des échantillons
Cliquer sur requête de service et soumission des échantillons pour consulter les instructions.
Contacter le Bureau de gestion clients pour toute question qui persiste quant à l’entrée des informations dans le formulaire de soumission, en particulier, ce qui concerne les adaptateurs, les index et si des index personnalisés ont été utilisés pour la construction des librairies.
Envoi des échantillons
Cliquer sur préparation des échantillons pour envoi pour consulter les instructions.
Transmission des résultats
Un message automatisé provenant de Nanuq est envoyé à l’investigateur principal et aux contacts associés au projet dès que les séquences sont disponibles.
Les résultats de séquençage sont directement accessibles par l’application web Nanuq.
Pour plus d’informations sur le téléchargement des données et les fichiers disponibles, consulter la page Foire Aux Questions.